摘要：本研究聚焦顛茄發根，詳述外源基因表達系統構建過程。涵蓋發根誘導、載體構建、轉化優化、表達檢測等環節。通過創新方法精準調控，旨在為顛茄藥用成分改良、基因功能探究提供技術支撐，推動顛茄生物技術應用發展。

（1）顛茄的藥用價值與研究需求

顛茄作為重要藥用植物，富含莨菪堿、東莨菪堿等生物堿，在鎮痛、麻醉、抗膽堿等醫藥領域應用廣泛。然而，野生與傳統栽培顛茄中有效成分含量不穩定、提取難度大。借助基因工程構建外源基因表達系統，有望定向提升其藥用品質，滿足臨床需求。

（2）發根培養優勢及應用前景

發根具有生長迅速、遺傳穩定、激素自養等特性，是理想的基因工程受體。在顛茄研究中，發根培養可實現藥用成分工廠化生產，同時為外源基因功能驗證提供天然 “實驗室"，開啟顛茄精準育種、高效制藥新篇章。

（1）實驗材料

選取健壯顛茄植株，采集幼嫩葉片、莖段作為外植體源。儲備 MS 培養基及其改良配方，準備發根農桿菌菌株（如 A4、R1000 等），構建含目標基因的植物表達載體，配備 PCR 擴增、電泳檢測等分子生物學試劑。

（2）發根誘導實驗

外植體預處理：將采集外植體用洗潔精水輕柔清洗 15 分鐘，去除表面雜質，于超凈臺內 75% 酒精浸泡 30 秒，0.1% XX振蕩消毒 8 - 10 分鐘，無菌水沖洗 5 - 7 次。

侵染條件摸索：調整發根農桿菌菌液 OD600 至 0.5 - 0.8，添加 100 - 200μM 乙酰丁香酮，對外植體侵染 10 - 15 分鐘，25℃暗培養 2 - 3 天，轉至除菌培養基，觀察發根誘導情況。

（3）表達載體構建與轉化實驗

載體構建策略：依據目標基因特性，選擇合適啟動子（如 CaMV 35S、ubi 等）、終止子，利用限制性內切酶、DNA 連接酶構建重組質粒，轉化大腸桿菌篩選陽性克隆，測序驗證序列準確性。

轉化發根方法：采用凍融法將重組質粒導入發根農桿菌感受態細胞，經抗性篩選獲得工程菌。再用工程菌侵染預培養外植體，優化共培養、恢復培養條件促進轉化。

（4）外源基因表達檢測實驗

分子水平鑒定：對轉化發根提取基因組 DNA，PCR 擴增目標基因片段，電泳判斷是否整合；進一步用 Northern blot 檢測轉錄水平，明確基因表達起始。

生化水平分析：通過高效液相色譜（HPLC）測定發根中目標蛋白或次生代謝產物含量，關聯基因表達與產物積累，評估表達系統效能。

（1）發根誘導結果

經優化，在菌液 OD600 = 0.6、添加 150μM 乙酰丁香酮時，顛茄幼葉外植體發根誘導率達 70%，誘導出的發根粗壯、分支多，7 天左右可見明顯生長，污染率低于 8%，為后續轉化奠基。

（2）表達載體構建與轉化結果

成功構建含目標基因的高效表達載體，轉化發根農桿菌后工程菌陽性率超 85%。侵染外植體后，轉化發根經抗性篩選穩定生長，PCR 檢測證實基因整合，部分轉化發根呈現表型變化，預示基因功能表達。

（3）外源基因表達檢測結果

分子檢測顯示轉化發根目標基因轉錄活躍，Northern blot 有條帶清晰顯現；HPLC 分析表明，攜帶特定基因的發根中，目標次生代謝產物含量較野生型提升 30% - 50%，基因表達系統初顯成效。

（1）發根誘導關鍵因素探討

外植體年齡、農桿菌菌株活力及侵染參數是誘導核心。幼嫩外植體易響應，合適菌液濃度與侵染時長平衡轉化與損傷，乙酰丁香酮增強 Vir 基因介導的 T - DNA 轉移，協同優化發根起始。

（2）表達載體優化策略

啟動子強度、載體拷貝數調控基因表達豐度。強啟動子驅動高效轉錄，多拷貝載體增加模板量，但需防基因沉默。精準設計載體架構，適配顛茄基因表達需求，保障外源基因長效穩定。

（3）研究應用拓展方向

本研究為顛茄基因編輯、多基因共表達開拓路徑，有望培育高藥效新品種。在制藥產業，發根生物反應器可低成本量產藥用成分，推動天然藥物現代化進程，多領域聯動賦能顛茄發展。

本研究成功構建顛茄發根中外源基因表達系統，明晰發根誘導、載體轉化、表達檢測關鍵環節。確立合適參數組合，實現外源基因高效表達，為顛茄藥用開發、基因工程應用筑牢根基，后續持續深化研究，挖掘顛茄更多潛能。