摘要：本研究旨在探討綠色熒光蛋白（GFP）作為標(biāo)志基因在快速篩選基因轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞中的應(yīng)用。通過(guò)構(gòu)建基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系，將GFP基因?qū)胪庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞（PBMC），并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)基因轉(zhuǎn)移效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GFP能有效標(biāo)記轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞，為基因治療中的細(xì)胞篩選提供了一種快速、準(zhǔn)確的方法。

引言

基因治療作為一種前沿的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，為遺傳性疾病和腫瘤性疾病的治療提供了新的希望。基因轉(zhuǎn)移是基因治療的技術(shù)基礎(chǔ)，而如何高效、準(zhǔn)確地篩選基因轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞則是基因治療成功與否的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的篩選方法，如基于藥物抗性的篩選，雖然有效，但耗時(shí)較長(zhǎng)，且可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響。因此，尋找一種快速、安全的篩選方法顯得尤為重要。

綠色熒光蛋白（GFP）作為一種生物發(fā)光蛋白，能夠在無(wú)需額外底物或輔因子的條件下發(fā)出綠色熒光。這一特性使其在生物學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用，特別是在細(xì)胞成像和基因表達(dá)監(jiān)測(cè)方面。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始探索將GFP作為標(biāo)志基因用于基因轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞的篩選。通過(guò)構(gòu)建含有GFP基因的載體，并將其導(dǎo)入靶細(xì)胞，可以利用GFP發(fā)出的熒光快速識(shí)別轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞。這種方法不僅操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，而且不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響，因此在基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究旨在探討GFP作為標(biāo)志基因在快速篩選基因轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞中的應(yīng)用，并構(gòu)建基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系，將GFP基因?qū)胪庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞（PBMC）。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)基因轉(zhuǎn)移效率，評(píng)估GFP作為篩選標(biāo)志的可行性和準(zhǔn)確性，為基因治療中的細(xì)胞篩選提供一種新的方法。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

• 實(shí)驗(yàn)試劑：某品牌DMEM培養(yǎng)基、某品牌胎牛血清（FBS）、某品牌PBS、某品牌胰酶、某品牌逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（含GFP基因、HSV-TK基因和NeoR基因）、某品牌polybrene、某品牌G418、某品牌淋巴細(xì)胞分離液等。

• 實(shí)驗(yàn)儀器：某品牌移液器、某品牌二氧化碳培養(yǎng)箱、某品牌倒置熒光顯微鏡、某品牌流式細(xì)胞儀、某品牌超凈工作臺(tái)、某品牌離心機(jī)等。

• 細(xì)胞株：外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PBMC的分離和培養(yǎng)

取健康志愿獻(xiàn)血者外周血58mL，肝素抗凝。使用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，用PBS洗滌2遍后，懸浮于含某濃度FBS、某濃度IL-2、某濃度PHA-P和某濃度CD3 McAb的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35天。

2.2 病毒上清的制備及其滴度測(cè)定

將含GFP基因、HSV-TK基因和NeoR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞在含某濃度G418的DMEM中培養(yǎng)至基本成層后，棄去上清，換用無(wú)G418的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18~24小時(shí)，收集上清即為病毒上清。以NIH3T3細(xì)胞株檢測(cè)病毒滴度，病毒效價(jià)=集落數(shù)×上清稀釋倍數(shù)（CFU/mL）。

2.3 基因轉(zhuǎn)染

取培養(yǎng)35天的PBMC懸浮于含某濃度polybrene和某濃度IL-2的病毒上清中，孵育812小時(shí)后，去除病毒上清及polybrene，加入含20%FBS的新鮮培養(yǎng)液。12天后，重復(fù)上述步驟，繼續(xù)與病毒上清孵育。如此反復(fù)轉(zhuǎn)染23次，轉(zhuǎn)染病毒滴度與細(xì)胞比為10:1。

2.4 倒置顯微鏡觀察

取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。轉(zhuǎn)換熒光光源，觀察GFP發(fā)出的綠色熒光，并計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)。

2.5 流式細(xì)胞儀分析

取轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用PE標(biāo)記的鼠抗人CD3、CD4、CD8和CD19單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞表面抗原標(biāo)記。參照檢測(cè)異硫氰酸熒光素（FITC）的常規(guī)方法（激發(fā)波長(zhǎng)475nm，發(fā)射波長(zhǎng)490nm），調(diào)整流式細(xì)胞儀工作條件至GFP（工作電壓525伏）。各管分別獲取10000個(gè)細(xì)胞數(shù)，測(cè)定不同CD抗原細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率。

2.6 PCR檢測(cè)外源基因整合

按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染后PBMC基因組DNA提取，以提取的DNA為模板，用NeoR基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察NeoR基因的整合情況。

結(jié)果

1. 病毒上清滴度測(cè)定

病毒上清滴度為3.75×10^6 CFU/mL。

2. PBMC的基因轉(zhuǎn)移

在倒置顯微鏡下觀察，重復(fù)轉(zhuǎn)染的PBMC生長(zhǎng)良好，膜光滑完整，胞漿豐富，核清晰可見(jiàn)。轉(zhuǎn)換熒光光源后，可見(jiàn)綠色熒光細(xì)胞，細(xì)胞飽滿。進(jìn)一步觀察PE標(biāo)記的鼠抗人CD單克隆抗體標(biāo)記的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，熒光視野下可見(jiàn)由GFP產(chǎn)生的綠色熒光細(xì)胞、PE產(chǎn)生的紅色熒光細(xì)胞及GFP和PE雙標(biāo)記細(xì)胞。

3. FACS測(cè)定不同CD抗原細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率

基因轉(zhuǎn)移效率按實(shí)驗(yàn)組UR測(cè)定值-陰性本底UR測(cè)定值計(jì)算。結(jié)果顯示，不同CD抗原細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率較高，轉(zhuǎn)化T細(xì)胞中CD4細(xì)胞亞群占較大比例，CD8細(xì)胞亞群及單核細(xì)胞也有一定的基因轉(zhuǎn)移率，B淋巴細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移率低。

4. 外源基因在PBMC基因組的整合

應(yīng)用PCR對(duì)轉(zhuǎn)染的PBMC DNA進(jìn)行NeoR基因鑒定，結(jié)果可見(jiàn)NeoR基因790bp的PCR產(chǎn)物電泳帶，表明轉(zhuǎn)染的外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組中有NeoR基因整合。

討論

本研究通過(guò)構(gòu)建基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系，將GFP基因成功導(dǎo)入外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了基因轉(zhuǎn)移效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GFP能有效標(biāo)記轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞，且不同CD抗原細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率存在差異。其中，T淋巴細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率較高，尤其是CD4細(xì)胞亞群。這一結(jié)果與之前的研究相符，表明T淋巴細(xì)胞在基因治療中可能具有更高的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平。

此外，本研究還通過(guò)PCR檢測(cè)了外源基因在PBMC基因組的整合情況。結(jié)果顯示，NeoR基因成功整合到PBMC基因組中，進(jìn)一步證實(shí)了基因轉(zhuǎn)染的成功。這一結(jié)果不僅為GFP作為篩選標(biāo)志的可行性提供了有力證據(jù)，也為后續(xù)基因治療研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

在策略上，本研究選擇了逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體，主要是因?yàn)槠渚哂休^高的轉(zhuǎn)染效率和安全性。同時(shí)，通過(guò)引入GFP作為標(biāo)志基因，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞的快速篩選。這種方法不僅操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，而且不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響，因此在基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

在創(chuàng)新方面，本研究將GFP作為標(biāo)志基因用于外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染篩選，并成功構(gòu)建了基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系。這一研究不僅豐富了基因治療中的細(xì)胞篩選方法，也為后續(xù)研究提供了新的思路和技術(shù)支持。

在應(yīng)用前景上，GFP作為標(biāo)志基因在基因治療中具有廣泛的應(yīng)用潛力。通過(guò)構(gòu)建含有GFP基因的載體，并將其導(dǎo)入靶細(xì)胞，可以利用GFP發(fā)出的熒光快速識(shí)別轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞。這種方法不僅適用于外周血單個(gè)核細(xì)胞，還可用于其他類型的細(xì)胞篩選。此外，隨著基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展，GFP作為標(biāo)志基因的應(yīng)用范圍也將進(jìn)一步擴(kuò)大。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化體系，將GFP基因?qū)胪庵苎獑蝹€(gè)核細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了基因轉(zhuǎn)移效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GFP能有效標(biāo)記轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞，為基因治療中的細(xì)胞篩選提供了一種快速、準(zhǔn)確的方法。這一研究不僅豐富了基因治療中的細(xì)胞篩選方法，也為后續(xù)研究提供了新的思路和技術(shù)支持。未來(lái)，隨著基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展，GFP作為標(biāo)志基因的應(yīng)用前景將更加廣闊。