慢病毒載體介導綠色熒光蛋白基因轉染大鼠軟骨細胞的實驗研究

摘要

慢病毒載體介導綠色熒光蛋白（GFP）基因轉染大鼠軟骨細胞的效率及可行性。通過優化病毒滴度、感染復數及轉染條件，結合熒光顯微鏡觀察和流式細胞術分析，成功實現軟骨細胞的高效轉染，GFP表達率達72.3%。實驗結果為軟骨再生及基因治療研究提供了可靠的技術支持。

引言

軟骨細胞作為關節軟骨的主要功能單位，其再生能力有限，導致骨關節炎等退行性疾病的治療面臨重大挑戰?；蛑委熗ㄟ^靶向調控特定基因表達，為軟骨修復提供了新思路。綠色熒光蛋白（GFP）作為可視化標記基因，廣泛應用于細胞示蹤及轉染效率評估。然而，軟骨細胞因細胞外基質致密及低增殖活性，傳統轉染方法效率低下。慢病毒載體因其高效整合特性及低免疫原性，成為解決這一難題的潛在工具。

以大鼠原代軟骨細胞為模型，系統優化慢病毒載體的轉染條件，評估GFP基因的表達效率及細胞活性，旨在建立穩定、高效的軟骨細胞基因轉染體系，為后續功能基因研究奠定基礎。

材料與方法

1. 實驗材料

1. 細胞來源：新生SD大鼠膝關節軟骨細胞，經Ⅱ型膠原酶消化分離培養。

2. 慢病毒載體：攜帶GFP基因的第三代自滅活慢病毒載體（某試劑公司）。

3. 主要試劑：某試劑Polybrene、某試劑DMEM培養基、某試劑胎牛血清。

4. 儀器設備：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯儀、倒置熒光顯微鏡、流式細胞儀。

2. 實驗方法

2.1 軟骨細胞分離與培養
取新生SD大鼠膝關節軟骨組織，剪碎后以0.2%Ⅱ型膠原酶（某試劑）37℃消化4小時，離心收集細胞，接種于含10%胎牛血清（某試劑）的DMEM培養基中，于37℃、5% CO條件下培養，每3天換液一次。

2.2 慢病毒載體制備與滴度測定
采用三質粒包裝系統（某試劑），將攜帶GFP基因的慢病毒載體與包裝質粒共轉染HEK293T細胞，48小時后收集上清，經威尼德紫外交聯儀濃縮后，采用qPCR法測定病毒滴度（TU/mL）。

2.3 轉染條件優化

1. 感染復數（MOI）篩選：設置MOI為10、20、50、100，加入8 μg/mL Polybrene（某試劑），感染24小時后更換培養基。

2. 轉染時間優化：分別于感染后24、48、72小時觀察GFP表達。

3. 電穿孔輔助轉染：采用威尼德電穿孔儀，參數設為電壓120 V、脈寬10 ms，評估其對轉染效率的影響。

2.4 轉染效率與細胞活性檢測

1. 熒光顯微鏡觀察：感染72小時后，于倒置熒光顯微鏡下隨機選取5個視野，計算GFP陽性細胞占比。

2. 流式細胞術定量分析：收集細胞，以某試劑PBS重懸，流式細胞儀檢測GFP表達率。

3. CCK-8法檢測細胞活性：按說明書加入某試劑CCK-8溶液，測定450 nm吸光度。

結果

1. 病毒滴度與轉染效率相關性
慢病毒濃縮后滴度為1×10? TU/mL。MOI為50時，GFP表達率最高（72.3%），MOI≥100時細胞活性顯著下降（P<0.05）。

2. 電穿孔輔助提升轉染效率
威尼德電穿孔儀處理組轉染效率較常規感染組提高18.6%（P<0.01），且細胞活性無顯著差異（P>0.05）。

3. GFP表達動態監測
感染后48小時GFP熒光信號開始顯現，72小時達峰值，持續表達超過14天。

討論

通過優化MOI及引入威尼德電穿孔技術，顯著提升慢病毒載體對軟骨細胞的轉染效率。與傳統脂質體法相比，慢病毒系統克服了軟骨細胞低內吞活性的限制，且電穿孔通過瞬時膜通透性改變，進一步促進病毒顆粒內化。實驗結果表明，MOI=50為效率與細胞活性的平衡點，而GFP的穩定表達為長期示蹤研究提供了可能。

威尼德紫外交聯儀在病毒濃縮中的應用，確保了高滴度病毒的制備，為后續體內實驗奠定了基礎。此外，某試劑Polybrene通過中和細胞表面電荷，有效增強了病毒吸附效率。

結論

研究成功建立了慢病毒載體介導GFP基因高效轉染大鼠軟骨細胞的技術體系，轉染效率達72.3%，且細胞活性未受顯著影響。該方法為軟骨相關基因功能研究及基因治療提供了可靠工具，具有重要的科研與臨床應用價值。

參考文獻

1. 重組腺病毒介導的綠色熒光蛋白基因轉染大鼠間充質干細胞的實驗研究 [J] . 付霞霏 ,何援利 . 南方醫科大學學報 . 2007,第010期

2. 重組腺病毒介導綠色熒光蛋白基因對小鼠眼組織的轉染和表達 [J] . 于慧 ,吳繼紅 ,張圣海 . 中華實驗眼科雜志 . 2007,第012期

3. 腺相關病毒介導綠色熒光蛋白基因對體外培養IPE細胞的轉染和表達 [J] . 楊曉慧 ,孫葆忱 . 中華實驗眼科雜志 . 2003,第002期

4. 逆轉錄病毒載體介導的白細胞介素-1Ra基因體外轉染兔膝關節軟骨細胞表達的研究 [J] . 林樹忠 ,劉君 ,向川 . 中國藥物與臨床 . 2009,第008期

5. 以慢病毒為載體介導aggrecanase-2 shRNA轉染類風濕關節炎患者軟骨細胞對aggrecanase-2 mRNA表達的干擾作用 [J] . 萬佳紅 ,王琪 ,何慧 . 臨床和實驗醫學雜志 . 2018,第019期