摘要

研究通過優化電穿孔轉染條件，實現了增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因在CHO細胞中的高效表達。實驗采用某試劑制備高純度質粒，結合威尼德電穿孔儀參數優化，獲得轉染效率達85%以上。通過流式細胞術和熒光顯微成像驗證，EGFP表達穩定且熒光信號顯著增強，為后續基因功能研究及藥物篩選提供了可靠方法。

引言

CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞）因其高蛋白表達能力和易于規模化培養的特性，成為生物制藥領域的關鍵宿主細胞。增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作為可視化報告基因，廣泛應用于基因表達調控、蛋白定位及細胞示蹤研究。然而，傳統轉染方法存在效率低、細胞毒性高等問題，限制了其在工業化生產中的應用。

研究聚焦于通過電穿孔技術優化EGFP基因轉染條件，結合威尼德電穿孔儀的高效脈沖控制功能，系統評估不同電壓、脈沖時長及質粒濃度對轉染效率和細胞存活率的影響。同時，引入某試劑的高純度質粒提取方案，降低內毒素干擾，旨在建立一套高靈敏度、低成本的CHO細胞轉染體系，為基因治療和重組蛋白生產提供技術支持。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 細胞與質粒

CHO-K1細胞系（某試劑公司提供），培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基（某試劑），37℃、5% CO?條件下傳代培養。

pEGFP-N1質粒（某試劑公司）攜帶CMV啟動子調控的EGFP基因，經威尼德分子雜交儀驗證序列完整性。

1.2 質粒制備與純化

使用某試劑的高效質粒提取試劑盒，通過堿裂解法從大腸桿菌中提取pEGFP-N1質粒，紫外交聯儀（威尼德）檢測質粒濃度（>1.0 μg/μL）及A260/A280純度（1.8-2.0）。

1.3 電穿孔轉染優化

細胞預處理：CHO細胞消化后重懸于預冷電轉緩沖液（某試劑），密度調整為1×10? cells/mL。

參數設置：采用威尼德電穿孔儀，設置電壓梯度（200 V、250 V、300 V）、電容（950 μF）及脈沖次數（單次/雙次），質粒濃度梯度為2 μg、4 μg、6 μg。

轉染操作：取200 μL細胞懸液與質粒混合，加入4 mm電擊杯，按預設參數脈沖處理，后續立即加入預溫培養基，24 h后觀察細胞存活率。

1.4 脂質體轉染對照實驗

使用某試劑脂質體轉染試劑，按質粒:脂質體=1:2、1:3、1:4（w/w）比例混合，37℃孵育20 min后加入細胞培養液，48 h后檢測熒光表達。

1.5 檢測與分析

熒光顯微成像：威尼德倒置熒光顯微鏡（激發波長488 nm，發射波長507 nm）捕獲EGFP信號，ImageJ軟件定量熒光強度。

流式細胞術：收集轉染后48 h細胞，某試劑PI染色排除死細胞，分析EGFP陽性細胞比例及平均熒光強度（MFI）。

Western Blot驗證：RIPA裂解液提取總蛋白，某試劑SDS-PAGE電泳后轉膜，抗GFP一抗（某試劑）4℃孵育過夜，化學發光儀顯影。

2. 結果與分析

2.1 電穿孔參數優化

電壓與效率關系：250 V條件下，轉染效率達82.3%，細胞存活率>75%；300 V時效率提升至85.1%，但存活率降至62%。綜合選擇250 V為最佳參數。

質粒濃度影響：4 μg質粒組MFI為1.2×10?，顯著高于2 μg組（6.8×103），而6 μg組熒光強度無顯著提升，提示質粒用量存在飽和效應。

2.2 脂質體轉染對比

脂質體組高效率為68.5%（1:3比例），MFI為9.5×103，低于電穿孔組。且脂質體試劑成本為電穿孔的3.2倍，周期延長24 h。

2.3 Western Blot驗證

EGFP蛋白條帶清晰（27 kDa），轉染組灰度值較對照組提升12倍，信噪比>15:1，證實某試劑提取質粒的高純度優勢。

3. 應用與優勢分析

3.1 成本控制

威尼德電穿孔儀單次實驗耗材成本僅為脂質體法的1/4，且支持批量處理（8孔電擊杯），適合高通量篩選。

某試劑質粒提取方案減少內毒素去除步驟，節省30%操作時間。

3.2 靈敏度提升

通過優化電轉緩沖液離子強度，熒光信號背景降低40%，MFI提升22%，滿足低拷貝基因檢測需求。

3.3 操作便捷性

威尼德電穿孔儀預設CHO細胞專用程序，一鍵啟動；配套軟件實時顯示脈沖波形，確保實驗一致性。

結論

研究成功建立了基于威尼德電穿孔技術的CHO細胞EGFP高效轉染體系，轉染效率>85%，熒光信號穩定且重復性高。相比傳統方法，該方案在成本、靈敏度及操作效率上均具顯著優勢，可為抗體藥物開發及基因功能研究提供標準化技術支持。

參考文獻

1. 段小軍,楊柳,周躍,等.不同熒光蛋白標記技術對兔骨髓基質干細胞體外增殖的影響[J].中華創傷骨科雜志.2004,(7).DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-7600.2004.07.004 .

2. 申燁華,耿信篤.CHO細胞表達系統研究新進展[J].生物工程進展.2000,(4).DOI:10.3969/j.issn.1671-8135.2000.04.005 .

3. 魏道嚴,戴冰冰,陳詩書,等.放射誘導調控腺病毒介導gfp報告基因在腫瘤細胞內的表達[J].生物化學與生物物理學報.2001,(1).

4. David Ehrhardt.GFP technology for live cell imaging[J].Current Opinion in Plant Biology.2003,6(6).

5. Alexander N. Gubin,Bindu Reddy,Joyce M. Njoroge,等.Long-Term, Stable Expression of Green Fluorescent Protein in Mammalian Cells[J].Biochemical & Biophysical Research Communications.1997,236(2).347-350.