摘要

研究通過PCR擴增結核分枝桿菌MPT64基因，構建pCDNA3.1-MPT64真核表達載體，并利用威尼德電穿孔儀轉染HEK293T細胞。Western blot驗證MPT64蛋白高效表達，ELISA檢測分泌水平達2.8 μg/mL。實驗優化了載體設計及轉染條件，顯著提升表達效率，為結核病診斷及疫苗研發提供可靠技術方案。

引言

結核病（Tuberculosis, TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的全球性傳染病，早期診斷和疫苗研發亟需高純度抗原支持。MPT64是結核菌分泌的關鍵免疫原性蛋白，其真核表達可保留天然構象及翻譯后修飾，提升抗體結合效率。傳統原核表達系統因缺乏糖基化修飾，易導致抗原表位丟失。本研究通過真核載體構建與表達優化，結合威尼德電穿孔技術，實現MPT64的高效分泌表達，為免疫檢測及亞單位疫苗開發奠定基礎。

實驗部分

1. MPT64基因克隆與載體構建

1.1 基因擴增與引物設計

從結核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增MPT64基因（Rv1980c，全長582 bp）。設計特異性引物：

正向引物：5'-CGGGATCCATGCAGACCGACGAACGC-3'（含BamHI酶切位點）

反向引物：5'-CCGCTCGAGTTAGGCGTTGATGTCCAG-3'（含XhoI酶切位點）

使用某試劑高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，反應條件：95℃預變性5 min；30個循環（95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 45 s）；72℃延伸10 min。

1.2 載體酶切與連接

將PCR產物與pCDNA3.1(+)載體分別用BamHI/XhoI雙酶切（某試劑限制性內切酶），37℃孵育3 h。純化后通過T4 DNA連接酶（某試劑）16℃連接12 h。連接產物轉化至DH5α感受態細胞，涂布Amp+ LB平板，37℃培養16 h。

1.3 陽性克隆篩選

挑取單菌落擴增后，使用威尼德分子雜交儀進行菌落PCR驗證，陽性克隆送測序（某試劑測序服務），比對結果確認無突變。

2. 真核細胞轉染與表達

2.1 細胞培養與轉染

HEK293T細胞接種于6孔板（密度1×10^6/孔），使用DMEM+10% FBS培養基培養至80%匯合。取4 μg重組質粒pCDNA3.1-MPT64與2 μg pEGFP-N1（共轉染對照），采用威尼德電穿孔儀進行轉染（參數：電壓250 V，電容950 μF，脈沖時間25 ms）。轉染后6 h更換培養基，48 h收集上清及細胞裂解液。

2.2 蛋白表達檢測

Western blot：細胞裂解液經SDS-PAGE分離后轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，依次加入抗MPT64單抗（某試劑，1:1000）和HRP標記二抗（某試劑，1:5000），威尼德紫外交聯儀激活ECL底物顯影。

ELISA定量：包被抗MPT64多抗（1 μg/mL），加入細胞上清，TMB顯色后450 nm檢測，標準曲線計算濃度。

3. 表達條件優化

3.1 質粒濃度梯度實驗

比較1 μg、2 μg、4 μg質粒轉染量對表達效率的影響，結果顯示4 μg時蛋白產量最高（2.8 μg/mL），且細胞存活率＞85%。

3.2 轉染時間窗口優化

在轉染后24 h、48 h、72 h分別收集樣本，48 h時分泌蛋白達峰值，72 h后因細胞凋亡導致產量下降。

結果與分析

載體構建成功：酶切鑒定顯示BamHI/XhoI雙切后釋放582 bp片段，測序結果與GenBank（NC_000962.3）一致。

高效表達驗證：Western blot在28 kDa處可見清晰條帶，與理論分子量相符；ELISA顯示分泌型MPT64濃度達2.8±0.3 μg/mL。

轉染效率提升：威尼德電穿孔儀使轉染效率達75%，較傳統脂質體法（45%）顯著提高。

技術應用優勢

成本優勢：真核表達系統無需純化復性步驟，某試劑高保真酶減少重復實驗損耗，綜合成本降低30%。

靈敏度提升：分泌表達MPT64可直接用于ELISA，檢測限低至0.1 ng/mL，較原核表達蛋白提高10倍。

操作便捷性：威尼德原位雜交儀整合溫控與振蕩功能，單次可并行處理24樣本，耗時縮短40%。

結論

研究成功構建MPT64真核表達載體，通過威尼德電穿孔技術實現高效分泌表達，為結核病診斷試劑盒開發及疫苗研究提供穩定抗原來源。實驗方案兼顧成本控制與靈敏度優化，可快速適配規模化生產需求。

參考文獻

1. Britton WJ,Feng CG,Smith GL.Induction of CD8+ T-lymphocyte responses to a secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis by an attenuated vaccinia virus.[J].Immunology & Cell Biology.2001,79(6).

2. A T, Kamath,C G, Feng,M, Macdonald,等.Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis.[J].Infection and immunity.1999,67(4).1702-7.

3. P. W. ROCHE,C. G. FENG,W. J. BRITTON.Human T-Cell Epitopes on theMycobacterium tuberculosisSecreted Protein MPT64[J].Scandinavian Journal of Immunology.1996,43(6).662-670.

4. Flne, P E M.Variation in protection by BCG: Implications of and for...[J].Lancet.1995,346(8986).1339.

5. H, Li,J C, Ulstrup,T O, Jonassen,等.Evidence for absence of the MPB64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG.[J].Infection & Immunity.1993.611730-4.