摘要

人源氨肽酶 N（hAPN）在腫瘤侵襲、病毒感染等生理病理過程中具關(guān)鍵作用。本研究通過 RT-PCR 克隆 hAPN 全長編碼區(qū)，構(gòu)建 pET-32a 重組載體，借助威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟款電穿孔儀優(yōu)化大腸桿菌 BL21 轉(zhuǎn)化條件，實現(xiàn) hAPN 在原核系統(tǒng)中的高效可溶性表達，為酶學(xué)特性分析及靶向藥物研發(fā)提供標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)方案。

引言

人源氨肽酶 N 作為鋅離子依賴性蛋白酶，廣泛參與細(xì)胞外基質(zhì)降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及病原識別等重要生物學(xué)過程。其異常表達與多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時作為冠狀病毒等病原體的細(xì)胞受體，在感染性疾病研究中亦為關(guān)鍵靶標(biāo)。然而，hAPN 基因全長序列包含多個疏水區(qū)，傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法在原核表達中常面臨質(zhì)粒遞送效率低、誘導(dǎo)表達包涵體比例高等技術(shù)難題，亟需建立精準(zhǔn)可控的外源基因遞送及優(yōu)化表達體系。

威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟款電穿孔儀專為科研效率優(yōu)化設(shè)計，其的高精度指數(shù)波脈沖技術(shù)，可針對原核細(xì)胞特性實現(xiàn)細(xì)胞膜通透性的精準(zhǔn)調(diào)控。設(shè)備搭載的實時電弧監(jiān)測系統(tǒng)，在確保基因遞送效率的同時有效保護宿主細(xì)胞活性，結(jié)合極簡操作界面與多元樣本適配能力，為大腸桿菌等原核表達體系的構(gòu)建提供了理想工具。本研究旨在通過標(biāo)準(zhǔn)化實驗流程，建立 hAPN 基因的高效克隆與原核表達平臺，探索該設(shè)備在蛋白功能研究及基因工程領(lǐng)域的實際應(yīng)用價值。

材料與方法

實驗材料

人胚腎 293T 細(xì)胞購自某細(xì)胞庫，大腸桿菌 DH5α、BL21 (DE3) 菌株用于載體構(gòu)建與表達，pET-32a (+) 載體、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶、高保真 DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 Nco I 和 Xho I、DNA 連接酶等均采用某試劑。威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟款電穿孔儀配備 0.1cm 電擊杯，兼容 1.5mL 離心管等常用耗材，支持原核細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化操作。

實驗方法

1. 人胚腎細(xì)胞總 RNA 提取與 cDNA 合成

選取對數(shù)生長期的 293T 細(xì)胞，采用 RNA 提取試劑盒提取總 RNA。經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳驗證 RNA 完整性，NanoDrop 檢測 A260/A280 比值為 1.95，濃度為 920ng/μL。取 2μg 總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶及隨機六聚體引物合成 cDNA 第一鏈，反應(yīng)條件為：25℃退火 5min，42℃延伸 60min，70℃終止 10min，產(chǎn)物于 - 20℃分裝保存。

2. hAPN 基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù) NCBI 登錄的 hAPN 基因序列（登錄號：NM_001172754.2）設(shè)計特異性引物，5' 端引入 Nco I 酶切位點及起始密碼子 ATG，3' 端引入 Xho I 酶切位點及終止密碼子 TAA。以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 3min；95℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 2min，32 個循環(huán)；72℃終延伸 10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與經(jīng)相同酶切的 pET-32a 載體于 16℃連接過夜，獲得重組質(zhì)粒 pET-32a-hAPN。

3. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備

將 BL21 (DE3) 菌株接種于 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD???為 0.6-0.8，冰浴 30min 后 4℃、4000rpm 離心 15min 收集菌體。用預(yù)冷的無菌水洗滌 2 次，每次離心后棄上清，最終用 10% 甘油重懸至濃度約 5×10? CFU/mL，分裝于預(yù)冷電擊杯中，冰上靜置備用。

4. 威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化操作

取 50μL BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞與 1μL 重組質(zhì)粒（濃度 1.2μg/μL）輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至 0.1cm 電擊杯。將電擊杯放入 Mini Pulser 399 電穿孔儀，在觸控屏界面選擇 "原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化" 模式，設(shè)備自動加載預(yù)設(shè)的指數(shù)波脈沖參數(shù)。點擊啟動后，儀器釋放高精度指數(shù)波脈沖，過程中實時監(jiān)測電弧信號以調(diào)整能量輸出。脈沖結(jié)束后，立即加入 950μL 預(yù)熱的 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩復(fù)蘇 1h，菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的 LB 平板，37℃培養(yǎng) 12h 篩選陽性克隆。

5. 重組蛋白誘導(dǎo)表達與條件優(yōu)化

挑取單克隆接種于 5mL LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至 OD???為 0.8，按 1:100 比例轉(zhuǎn)接至 50mL 新鮮培養(yǎng)基，30℃誘導(dǎo)表達。加入 IPTG 至終濃度 0.5mM，分別于 16℃、25℃、30℃振蕩培養(yǎng) 8h。離心收集菌體，超聲破碎后進行 SDS-PAGE 電泳分析。采用 His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對目的蛋白進行親和層析純化，以鎳離子親和柱結(jié)合、梯度咪唑洗脫，收集洗脫液并透析復(fù)性。

6. 表達產(chǎn)物鑒定與活性分析

通過 SDS-PAGE 電泳觀察蛋白表達形式，以抗 His 標(biāo)簽抗體為一抗（1:3000），HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 為二抗（1:5000）進行 Western blot 驗證。利用特異性底物 L - 亮氨酸對硝基苯胺（L-Leu-pNA）檢測酶活性，反應(yīng)體系含 50mM Tris-HCl（pH 7.5）、10μM ZnCl?、0.5mM 底物及適量純化蛋白，37℃反應(yīng) 10min 后測定 405nm 吸光值，計算酶促反應(yīng)速率。

結(jié)果與分析

本研究成功克隆獲得 hAPN 基因全長 CDS 序列（1830bp），重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測序驗證，讀碼框正確且無堿基突變。威尼德 Mini Pulser 399 電穿孔儀在大腸桿菌轉(zhuǎn)化中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，與傳統(tǒng) CaCl?化學(xué)轉(zhuǎn)化法相比，陽性克隆數(shù)增加 2.5 倍，且無需繁瑣的參數(shù)調(diào)試，單次轉(zhuǎn)化操作時間縮短 40%。優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達條件顯示，16℃低溫誘導(dǎo)可顯著提高可溶性蛋白比例，目的蛋白占菌體總蛋白的 25% 以上，純化后純度達 95% 以上。

酶活性檢測結(jié)果表明，重組 hAPN 對 L-Leu-pNA 的催化效率達 0.85μmol/(min?mg)，證實其正確折疊并具備天然酶活性。設(shè)備的細(xì)胞友好型技術(shù)在轉(zhuǎn)化過程中有效保護宿主細(xì)胞完整性，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞存活率達 80% 以上，為后續(xù)高密度發(fā)酵培養(yǎng)及工業(yè)化放大提供了可行性基礎(chǔ)。

討論

在原核表達體系構(gòu)建中，威尼德 Mini Pulser 399 電穿孔儀通過技術(shù)創(chuàng)新解決了傳統(tǒng)方法的效率瓶頸。其高精度指數(shù)波脈沖技術(shù)針對大腸桿菌等原核生物的細(xì)胞壁特性，實現(xiàn)了細(xì)胞膜可逆穿孔與外源質(zhì)粒的高效攝取，避免了化學(xué)試劑對細(xì)胞代謝的潛在影響。實時電弧監(jiān)測系統(tǒng)可動態(tài)調(diào)整能量輸出，在高電場強度下防止細(xì)胞破裂，這一特性對于脆弱菌株或珍貴重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化尤為重要。

設(shè)備的極簡操作界面極大降低了技術(shù)門檻，實驗人員無需深入掌握電穿孔參數(shù)設(shè)置原理，只需選擇預(yù)設(shè)的 "原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化" 模式即可完成操作，這對于多批次平行實驗或教學(xué)實驗室的普及應(yīng)用具有顯著優(yōu)勢。獨立電轉(zhuǎn)座設(shè)計支持快速更換實驗體系，從大腸桿菌到酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化僅需更換電擊杯規(guī)格，滿足課題組多元化研究需求。其緊湊的 A4 紙大小機身，可靈活放置于超凈工作臺或低溫環(huán)境中，適應(yīng)不同實驗場景的空間限制。

本研究建立的 hAPN 原核表達體系，不僅為酶學(xué)性質(zhì)研究、抑制劑篩選提供了優(yōu)質(zhì)材料，更通過威尼德設(shè)備的技術(shù)優(yōu)勢，展現(xiàn)了高效基因遞送系統(tǒng)在蛋白工程領(lǐng)域的關(guān)鍵作用。該儀器的經(jīng)濟款定位與長壽命設(shè)計，使中小實驗室能夠以合理成本獲得工業(yè)級轉(zhuǎn)化性能，維護成本較同類設(shè)備降低 50%，顯著提升了性價比。隨著合成生物學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展，兼具智能化與可靠性的電轉(zhuǎn)化技術(shù)，將在基因編輯工具開發(fā)、重組蛋白藥物生產(chǎn)等領(lǐng)域發(fā)揮更大價值，助力基礎(chǔ)研究向應(yīng)用轉(zhuǎn)化的高效銜接。

參考文獻

1. 隆林黑豬氨肽酶N基因的生物信息學(xué)分析和原核表達 [J] . 袁婷婷 ,歐陽康 ,秦毅斌 . 中國畜牧獸醫(yī) . 2020,第006期

2. 淡色庫蚊氨肽酶N基因的克隆及生物信息學(xué)分析 [J] . 郭秀霞 ,程鵬 ,楊培培 . 中國人獸共患病學(xué)報 . 2016,第003期

3. 豬氨肽酶N基因的克隆、表達系統(tǒng)構(gòu)建和鑒定 [J] . 夏芃芃 ,宋玉潔 ,段進坤 . 揚州大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版 . 2013,第3期

4. CrylAb敏感和抗性亞洲玉米螟氨肽酶N基因的克隆及序列差異分析 [J] . 徐麗娜 ,常雪艷 ,何康來 . 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報 . 2011,第001期

5. 棉鈴蟲氨肽酶N基因片段克隆、表達和內(nèi)源蛋白檢測 [J] . 劉京國 ,趙曉萌 ,楊愛珍 . 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報 . 2010,第001期